Die Animations-Serie basiert auf der erfolgreichen Videospielreihe „Tom Clancy’s Splinter Cell“ und folgt dem ehemaligen U.S. Navy SEAL Sam Fisher (Liev Schreiber), der als Agent der Geheimorganisation Third Echelon der National Security Agency (NSA) Aufträge ausführt. Dabei handelt es sich um eine Spezialeinrichtung der Vereinigten Staaten, die gegen die immer größer werdende Bedrohung des Cyber-Terrorismus vorgeht. Die Agenten werden als Splinter Cells bezeichnet, sind stets allein im Einsatz und dabei völlig auf sich gestellt. Während sie permanente Verbindung zum Hauptquartier pflegen, sind ihre Missionen streng geheim und werden von der US-Regierung offiziell geleugnet.